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自体皮肤成纤维细胞在医学美容中的应用研究
发布时间：2023-10-30 16:38
引 言 1
第——章材料和方法 3
一、 体外实验 3
二、 体内实验 11
第二章实验结果 15
一、 体外实验 15
二、 体内实验 20
第三章讨论 25
第四章结论 31
参考文献 32
中文摘要 1
英文摘要 4
致 谢
随着社会经济的发展，人民生活水平的提高，医学美容已经成为目前 最有发展潜力和市场的学科之一。其中，医学美容除皱作为美容的重要组 成部分，也日益成为国内外众多学者的关注热点。目前，在国内美容除皱 的方法主要有面部提紧术、化学去皮、激光除皱和生物制剂注射法等等， 但都存在着不同的副作用，不能安全有效的解决除皱问题。所以揭示皱纹 产生的机制，从根本上解决除皱问题是非常重要的。
皮肤是人体面积最大的器官，由真皮和表皮构成。真皮位于表皮的深 面，在真皮网织层中的主要细胞是成纤维细胞(fibroblasts, Fbs)⑴，它 能合成和分泌大量的胶原蛋白以及少量的弹性蛋白，于细胞外聚合成为粗 大的胶原纤维束和细小的弹性纤维束。胶原纤维是Fbs合成和分泌的主要 结构蛋白，它约占真皮干重的75%。成年人皮肤真皮层的胶原纤维主要 分为I型和III型胶原，其中I型胶原约占皮肤胶原成分的70%~80%[23], 在真皮中聚集成与皮面平行的、粗大且相互交织成网的纤维束，具有高度 机械稳定性，是维持皮肤张力和承受拉力的重要成分，也是维持皮肤饱满 充盈的物质基础。III型胶原是幼稚、纤细的胶原纤维，在胚胎皮肤胶原成 分中约占50%,至成年后约占皮肤胶原含量的30%,仅见于表皮和皮肤 附属器周围，呈疏松网状排列，在创伤愈合等情况下可大量增长⑷5]o弹 性纤维约占真皮干重的1 %〜2 % ,对保持皮肤弹性和顺应性起重要作用o 在体内新陈代谢中，胶原纤维和弹性纤维不断衰老，被胶原酶和蛋白水解 酶等酶类破坏掉，同时成纤维细胞产生新的胶原纤维和弹性纤维来代替⑹。
随着年龄的增长，由于生理或病理因素，新陈代谢的平衡被破坏，皮 肤Fbs抗酶破坏力降低，数量不断减少，胶原纤维和弹性纤维的数量和质
量也随之减少，真皮层结构发生改变，真皮层厚度慢慢变薄，弹性变差, 逐渐衰老，在表情肌运动较多的部位皮肤松弛产生了皱纹⑺。由此而知， Fbs的减少是引起皱纹产生的重要原因。
本实验着力围绕皮肤真皮层成纤维细胞培养技术、整体动物凹陷性创 伤修复等体内体外实验，对成纤维细胞进行了相关的探讨研究，以期为成 纤维细胞在医学美容中的应用提供可靠的科学依据。
技术路线:
第一章 材料和方法
一、体外实验
（一）Fbs的培养、鉴定及生物性状研究
1.实验材料
1.1皮肤来源
皮肤标本50例，均取自因施行割双眼皮、切除眼袋之女性眼睑周围 部位的皮肤，患者年龄在35〜50岁之间，由长春市铭医美容院提供。
1.2实验动物
雄性Wistar大鼠，体重为250〜300 g,由吉林大学白求恩医学部动物 部提供。
1.4仪器
JJ200型精密电子天平 美国
磁力加热搅拌器 国产
手提式压力蒸汽灭菌器 上海
不锈钢电热蒸馄水器 国产
co2孵箱 美国
超净工作台 国产
离心机 国产
倒置显微镜 日本
1.5试剂配制
(1)RPMI-1640培养液的配制：RPMI-1640培养基干粉一袋，碳酸氢 钠l・2g〜l・5g,二性霉素B0.25 mg,青霉素10万单位，链霉素10万单 位，加二蒸水至1000 mb用1 mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液或1 mol/L 盐酸(HC1)溶液调pH值7.0-7.4之间。经0.22 pm的滤膜除菌，分装, 置4 °C冰箱保存备用。
(2)0.01 mol/L PBS 的配制：
NaCl 8.00 g
KC1 0.20 g
Na2HPO4-H2O 1.56 g
KH2PO4 0.20 g
加二蒸水1000 ml搅拌器混匀配成溶液，调pH值至7・2〜7・4,高压 灭菌后备用。
(3)0.25%胰蛋白酶的配制：称取0.25 g的胰蛋白酶加入无C『+、Mg2+ 的PBS (pH 7.2〜7.4)。经0.22^1 m的滤膜除菌。置于4 °C冰箱备用。
(4)0.25% IV胶原酶配制：称取0.25 g胶原酶，加入100 ml含10%胎 牛血清(性tai bovine serum, FBS)的 RPMI-1640 培养液中，经 0.22 pm 滤膜除菌。置于4 °C冰箱备用。
(5)脱毛剂的配制：硫化钠3g,肥皂水lg,淀粉7g,加水混合，调 成糊状软膏，现用现配。
(6)4%台盼蓝母液：称取4 g台盼蓝，加少量双蒸水研磨，双蒸水定 量至100 mh用滤纸过滤，4 °C保存。使用时，用PBS稀释至0.4% o
(7)MTT (嚏卩坐蓝)溶液：称取250 mg MTT,放入小烧杯中，加50 ml PBS在磁力加热搅拌器搅拌30 min,用0・22 pm的滤膜除菌，分装4 °C保 存。临用前两周配制。
1.6盖玻片处理：将10x10mm2盖玻片在硫酸■重锯酸钾清洗液中浸泡 过夜，清水充分清洗后，一蒸水洗三遍，二蒸水洗两遍。烘干后，高压消 毒，备用O
2. Fbs的分离和培养
2.1人皮肤Fbs的原代培养
(1)在超净工作台里，将取回的皮肤放置培养皿中，PBS反复漂洗， 用无菌剪刀把皮肤剪成5mmx5mm的小块。0.25%胰蛋白酶消化，4 °C冰 箱过夜。
(2)次日，在超净工作台里取出皮肤，PBS洗3次。
(3)用眼科剪子和银子，轻轻刮去表皮和皮下组织，保留真皮。将皮 肤组织剪碎。
(4)组织碎块用0.25% IV型胶原酶37 °C消化4 h。200目滤网过滤， 将过滤的液体加入离心管，1000 rpm离心15 min,去除上清加入含10% FBS的RPMI-1640培养液，轻轻吹打成细胞悬液。
（5） 计数，细胞以1x10°的密度接种到25 ml的培养瓶，加入4 ml含 10% FBS的RPMI-1640培养液，置于37 °C、5%CO2及饱和湿度条件的 CC>2孵箱培养。
（6） 静止培养3d后，倒置显微镜下观察、换液，以后隔日换液。
2.2大鼠背部皮肤Fbs的原代培养
健康Wistar大鼠乙醍麻醉后，用脱毛剂脱去整个背毛，再用20%碘 酒、75%酒精消毒背部皮肤。切除两侧背部皮肤各约3 cmx3 cm大小的范 围（对称），将切下的皮肤块放在75%酒精浸泡1 min,移入无菌超净工 作台；皮肤组织块置于无菌培养皿中，PBS反复漂洗，用无菌剪刀把皮肤 剪成5 mmx5 mm的小块，0.25%胰蛋白酶消化，4 °C冰箱过夜；次日， 步骤同2.1⑵〜⑹。
2.3细胞传代
当细胞生长融合率达90%以上时，倒掉瓶内旧培养液，用PBS洗三 次，加入1 ml的0.25%胰蛋白酶溶液，消化1〜3 min后把培养瓶放置在 倒置显微镜下进行观察，发现细胞回缩、细胞间隙增大后，加含10% FBS 的RPMI-1640培养液终止消化。用弯头吸管轻轻吹打，使细胞脱离瓶壁 后形成细胞悬液，计数，以1:3的比例接种至100 ml培养瓶中叫 待细胞 生长融合率达90%以上，进行下一次传代。
3. Fbs的鉴定
3.1形态学观察
（1） 将lOxlOmm2盖玻片进行处理高压后放入消毒灭菌后的24孔板， 再用紫外照射15 mine
（2） 将细胞以1x104的密度接种至24孔培养板中继续培养。隔日换 液。
(3)待细胞生长至单层，吸出上清，用PBS洗板三次。95%酒精固定 30 min。PBS 洗 2 次，每次 1 min。
(4)常规HE染色：苏木素染核，自来水洗，稀盐酸酒精溶液分色， 自来水洗，淡氨水使胞核蓝化，自来水洗，伊红染胞桨，梯度酒精脱水， 二甲苯透明。
(5)载玻片上滴加中性树胶，将有细胞一面的盖玻片向下封固于载玻 片上。
3.2应用细胞免疫组化方法鉴定培养细胞
(1)将lOxlOmm2盖玻片进行处理高压后放入消毒灭菌后的24孔板， 再用紫外照射15 mine
(2)将细胞以1x10°的密度接种至24孔培养板中继续培养。隔日换 液。
(3)3d后吸出上清，用PBS洗板3次。取出盖玻片，经10%甲醛 固定30 min。
(4)用PBS洗板，加20 pl 30%过氧化氢(H2O2),室温下10 min, PBS 洗。
⑸去除PBS,加20卩1封闭用的正常山羊血清工作液，室温 10 min。
⑹ 去除血清，加入稀释后的波形蛋白(vimentin)鼠抗单克隆抗体， 4 °C湿盒中过夜。
(7)PBS洗，去除PBS,加20卩1稀释后的生物素化抗小鼠IgG。室温 30 min, PBS 洗。
(8)去除PBS,加20卩1过氧化物酶室温30 min, PBS洗。
(9)去除PBS,加1滴新鲜配置的DAB显色液，3〜5 mine
(10)自来水冲洗，苏木素复染3 mine自来水洗，稀盐酸酒精溶液分色, 自来水洗，淡氨水使胞核蓝化，自来水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明。
(11)载玻片上滴加中性树胶，将有细胞一面的盖玻片向下封固于载玻 片上。
(12)光学显微镜100倍视野下观察，计阳性细胞数的百分比。
4. Fbs生长状况观察
4.1Fbs的活力检测
(1)制备单个细胞悬液，密度为lxl06o
(2)染色：取9滴细胞悬液移入试管，加一滴0.4%台盼蓝溶液，混匀。
⑶ 计数：在3 min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞数。
⑷活细胞率计算公式：
活细胞数
活细胞率= xlOO%
活细胞数+死细胞数
4.2Fbs生长曲线
MTT是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中的脱氢酶在细胞 内可将黄色的MTT转化成不溶性蓝紫色formazan,而死的细胞则无此功 能。Fomiazan的生成量在通常情况下与活细胞数成正比，用二甲基亚砚 (dimethyl sulphoxide , DMSO)溶解 formazan 后，在 490 nm 波长下用 酶标仪测定光密度(OD)值，即可定量测出细胞的存活率及细胞的增殖 情况。
(1)接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化融合率为90%以上的细胞，用 含10% FBS的RPMI-1640培养液终止，配成1x10?的细胞悬液并接种到 96孔培养板中，每孔200 ^lo
(2)培养细胞：将培养板放入CO?孵箱，在37 °C、5%CO2及饱和湿 度条件下培育。每天取12孔，做MTT,连续7d。
(3)显色：每孔加MTT溶液(5 mg/ml) 20(11, 37 °C继续孵育4 h,终 止培养。吸出上清，每孔加入150 pl DMSO,振荡10 min,使之充分溶 解。
⑷ 比色：选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值 (OD值)。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制生长曲线。
4.3 Fbs的冻存和复苏
(1)细胞冻存：选对数生长期细胞,0.25%胰蛋白酶消化，含10% FBS 的RPMI-1640终止，计数并离心1000 rpm, 5 min。去除胰蛋白酶和旧培 养液，加入配制好的冻存液，细胞终密度为lxl07o从低到高梯度降温罔, 最后投入液氮里。
(2)细胞复苏：把冻存管从液氮中取出，37 °C水浴，酒精消毒后开启， 用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加10倍以上的培养液，混合后低速 离心，去除上清液，再用培养液洗一次。适当稀释后，以3^105接种培养 瓶，CO?孵箱静止培养，隔日换液。
4.4复苏后Fbs的活力检测和生长曲线：活力检测方法同上(4.1)。 选对数生长期的细胞，0.25%胰蛋白酶消化，含10% FBS的RPMI-1640 培养液终止，稀释至终浓度为lxlO4,接种24孔板，放入CO?孵箱培养, 次日更换培养液。每隔24 h收集3孔细胞计数，取平均值。连续7d。以 培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，绘成生长曲线。
(二)Fbs的胶原合成情况
1.主要试剂和仪器
轻脯氨酸测试盒 南京建成公司
Collagen I山羊抗大鼠多克隆抗体 武汉博士德生物工程公司
生物素标记二抗IgG
UV755B型紫外可见光光度计
DG5031型酶联免疫检测仪
2.试剂配制
ELASA试剂的配制：
(1)包被稀释液：取Na2CO3 1.59 g> NaHCOs 2.94 g,加二蒸水至
1000 mlo
(2)封闭液：用PH 7.4的PBS配制1%牛血清白蛋白(bovine serum
albumin, BSA)。
(3)洗涤液(PBST)： Tween20 0.5 ml 加 pH 7.4 的 PBS 至 1000 mL
⑷ 终止液：60 ml二蒸水中缓慢滴入浓硫酸10 mL
⑸底物缓冲液和显色液：
①磷酸■柠檬酸缓冲液pH (5・0〜5.5)
A液(0.1 mol/L柠檬酸溶液)24.3 ml
B 液(0.2 mol/L Na2HPO4 溶液)25.7 ml
②加入邻苯二胺至终浓度为5 mg/ml,充分溶解，最后加入25卩1 30%
H2O2o
3.Fbs培养液中轻脯氨酸含量的测定
收集不同时间点的细胞培养液，用径脯氨酸检测试剂盒测定其轻脯氨 酸(hydroxyproline, HYP)含量。取细胞上清0.25 ml,标准管加5 yg/m 1标 准应用液0.25 ml,空白管加0.25 ml蒸惚水。各管均加试剂盒中的试剂一 0.5 ml,混匀，室温静置10 mine加入试剂二0.5 ml,混匀，室温静置5 min。 加入试剂三0.5 mh混匀。60 °C水浴15 min,冷却后，3500 rpm , 10 min, 取上清在UV755B型紫外可见光光度计550 nm波长处，蒸憾水调零，测
各管吸光度(0D)。
结果计算：
测定管吸泌空白管吸艇 水解液总量ml)
轻脯氨酸含量(嗣)= x5
4.Fbs培养液中I型胶原含量测定
收集不同时间点的细胞培养液，用ELISA方法检测细胞培养液I型 胶原含量。检测步骤：
(1)将细胞上清和包被液按1:1比例加入96孔酶标板中，100卩1/孔， 4 °C过夜。
(2)吸出上清液，加入封闭液200(11/孔。
(3)洗板：PBST 洗,3minx3o
(4)加一抗：1:1000稀释，100卩1/孔。
(5)弃一抗，PBST 洗,3minx3o
(6)加二抗，1:1000稀释。100卩1/孔，置于37 °C孵箱，1.5h。
(7)弃二抗，PBST 洗，3minx3o
(8)加显色液100卩1/孔，室温避光反应3〜5 mine
⑼ 当有颜色变化时加入终止液50卩1/孔，显色由橙黄色转向棕黄色。
(10)酶联免疫检测仪检测OD值(429 nm)o
(三)统计学处理 数据用均值士标准差(匚士 s )表示，以单因素 方差分析LSD法(统计软件SPSS10.0 )进行统计学检验。P < 0.05或 P<0.01有显著性差异。
二、体内实验
（一）材料和方法
1.实验材料
1.1实验动物
Wistar雄性大鼠8只，体重250〜300 g,由吉林大学白求恩医学部动 物部提供。
1.2主要试剂
vimentin鼠抗单克隆抗体 武汉博士德生物工程公司
collagen I山羊抗大鼠多克隆抗体
collagen III山羊抗大鼠多克隆抗体
S-ABC免疫组织化学试剂盒 武汉博士德生物工程公司
武汉博士德生物工程公司
福州迈新生物技术公司
DAB显色试剂盒 福州迈新生物技术公司
苏木素、丽春红 上海惠世生化试剂公司
其它试剂
1.3主要仪 国产分析纯
Leica・2245切片机 德国
XSZ-8D光学显微镜 国产
DigimaxVIO数码照相机
2・方法 日本
2.1凹陷性创伤模型的复制及修复实验
取健康Wistar大鼠8只，经乙酉迷麻醉后，将大鼠固定于固定台，用脱 毛剂脱去整个背毛，常规手术消毒。在背部脊柱两侧各切除约3 cmx3 cm的 皮肤及少许深部肌层（对称）。创面用手术线缝合造成凹陷性瘢痕。切创 后，每只大鼠分笼饲养，注意清洁，防止伤口感染。每日观察动物全身反 应以及创面愈合情况。同时将切下的皮肤按上述体外实验2.1的Fbs培养 方法进行培养。
待培养细胞传至3代，生长融合率达90%以上时(约切创后21 d), 用传代方法进行消化、离心，再用lml PBS稀释成密度为1x10?细胞悬液, 注射到大鼠左侧瘢痕的真皮层(注射细胞侧)。以右侧瘢痕为对照(瘢痕 对照侧)，每日观察注射细胞后瘢痕变化情况，直至第7d。乙瞇麻醉后处 死大鼠，取下实验部位皮肤，留做组织学检测之用，具体方法见后。
2.2形态学观察
常规HE染色标本制备：甲醛固定，石蜡包埋，4pm厚的切片，二 甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，常规HE染色。
2.3Masson三色染色
(1)切片常规脱蜡至水。
(2)苏木素染核2 min,流水冲洗。
(3)丽春红品红液染5 min,显微镜下控制。
⑷0.5%冰醋酸水溶液快速冲洗。
(5)1%磷钮酸水溶液快速处理，其切片由深红色至鲜红色至粉红色， 其颜色的掌握度必须在显微镜下控制。
⑹ 直接用苯胺蓝染色。
(7)0.5%冰醋酸水溶液快速冲洗。
(8)常规脱水，二甲苯透明，封片。
2.4vimentin> I型和III型胶原免疫组化染色
(1)切片常规脱蜡至水。
(3)30% H2O2 1份加蒸馄水9份混合，室温作用5〜10 min以灭活
内源性酶。
⑷蒸憾水水洗3次。
(5)vimentin染色切片用枸椽酸修复液修复10 min； I型和III型胶原染 色切片用酶抗原修复5 min,显微镜下观察。PBS洗3次。
(6)滴加正常山羊血清封闭液，室温15 mine甩去多余液体。
(7)滴加适当稀释的一抗，4 °C过夜。PBS洗3次。
(8)滴加生物素化二抗IgG , 37 °C 20 min, PBS洗3次。
(9)滴加试剂 S-ABC, 37 °C 20 min, PBS 洗 3 次。
(10)DAB显色：室温显色，镜下控制反应时间，一般在3〜5 min之 间。蒸惚水洗涤。
(11)苏木素复染：浸入苏木素染液染色2 min ,自来水洗，迅速过盐 酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
(12)常规脱水，二甲苯透明，封片。
第二章 实验结果
、体外实验
（一）Fbs的培养、鉴定及生物性状研究
1 •倒置显微镜下观察
人皮肤Fbs接种24 h后，细胞逐渐呈放射状伸展开来，中心随之扁 平，接种3〜5 d细胞开始缓慢生长，约7〜9 d融合成片，融合生长的Fbs 呈长梭形，排列方式为旋涡状（图1A）。
大鼠皮肤Fbs接种4 h后贴壁，呈长梭形，生长迅速，随着细胞的增 殖，2〜3d融合状态，细胞紧密排列，其排列方式为旋涡状、放射状或栅 栏状（图1B）O
图1.倒置显微镜下Fbs的形 扶Fbs接种7 d后呈融合状态；1B示
大鼠皮肤Fbs接种3d后呈融合状态（xlOO）。
2.形态学观察
对培养第3代的细胞进行HE染色、光镜下观察，见细胞为多角形或
长梭形，核较大，胞质较多，胞浆着粉红色，胞核着蓝紫色，如图2所示。
3・vimentin免疫组化染色
S-ABC法对培养的细胞进行vimentin染色。染色结果发现，胞浆呈 现棕黄色颗粒状反应，胞核不着色，可见大于98%的细胞染色阳性。证 明细胞含有波形蛋白，是Fbs,结果如图3所示。
图3. vimentin免疫组织化学染色
（DAB 显色，x200）o
4.Fbs的活力检测
台盼蓝排斥实验是最常用的细胞活力检测方法。细胞死亡时，台盼蓝 染料可穿透死细胞膜，与解体的DNA结合，使细胞着色，而活细胞能阻 止染料进入细胞内，故而不着色。据此可将死细胞与活细胞鉴别开来。本 实验连续三次取对数生长期细胞重复做台盼蓝排斥实验，于倒置显微镜下 观察，极少数细胞被染成淡蓝色，绝大多数细胞拒染。三次检查的活细胞 率分别是 98%、100%、100% o
5.Fbs的生长曲线
以lxlO3的密度接种Fbs到96孔板，在一定时间内，细胞数量随时 间的增加而增殖，于第5 d时长满，生长状态良好。3〜7d的细胞增殖与
Od相比有显著差异(P<0.01)o以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制生长 曲线，其潜伏期、对数生长期、平台期分别为0〜Id、1〜5d、5〜7d, 生长曲线见表1和图4。
表1 Fbs增殖能力测定(n=12 )
Group (d) OD值
0 0・56±0・04
1 0・56±0・0对
2 0.64±0.06*
3 0・75±0・08从
4 0・78±0・04"
5 0・99±0・09从
6 0・96±0・02小
7 0・87±0・05"
注：与Od相比，*表示FV0.05； **表示P<0.01o
时问⑻
图4.不同时间点Fbs生长曲线
6. Fbs的冻存及复苏后的活力检测与生长曲线
Fbs复苏后，进行活力检测，细胞复苏状态良好，复苏成活率约为85%。 倒置显微镜下见细胞形态与冻存前无明显差别。以lxl（）4的密度接种Fbs 到24孔板，用细胞计数法计数每孔细胞数，每天3孔，连续7d。以培养 时间为横轴，细胞数量为纵轴，绘成生长曲线。所得曲线与复苏前MTT 法所做曲线基本相似，结果见表2和图5。证明Fbs的生物学性状稳定， 可成功冻存及复苏。
表2复苏后Fbs增殖能力测定（兀士s, n = 3 ）
Group (d) 细胞数（xlO4）
0 1.00±0.00
1 l・08±0・14
2 l・50±0・25
3 2・17±0・3旷
4 4・58±0・38"
5 5・75±0・66"
6 5・50±l・14"
7 4・67±0・38"
注：与0d相比,*表示FV0.05； **表示P < 0.01 o
时问⑻
图5.复苏后Fbs生长曲线（xl0°）
（二）Fbs的胶原合成情况
1. Fbs培养液中轻脯氨酸含量的测定
由于培养细胞合成的胶原直接分泌到培养液中，因此通过测定培养液 中HYP的含量，可间接反映培养细胞胶原蛋白的合成量。收集不同时间 点Fbs的培养液，用疑脯氨酸测试盒测定HYP含量。结果显示，培养液 中HYP含量随细胞的增殖而增加，至第3〜5 d的HYP含量与第1 d相比 有显著差异（尸＜0.01）,具体情况如表3和图6所示。
表3不同时间点Fbs培养液中HYP含量（匚士s, n=3 ）
Group (d) HYP (ug/ml)
1 3・85±0・16
2 5・13±0・08
3 9.40±0.09**
4 13・99±0・30"
5 18.00±0・23"
6 7・38±0・47*
7 3.63±1.72*
注：与Id相比,*表示FV0.05； **表示FV0.01。
图6・不同时间点Fbs培养液中HYP含量
2. Fbs培养液中I型胶原含量测定
用ELISA方法测定培养液中I型胶原含量的结果显示，I型胶原
含量随时间的增加而增加，2〜6d I型胶原含量与1 d相比有显著差 异(P< 0.01),如表4和图7所示。
表4 Fbs培养液中I型胶原胶原含量测定(匚士s, n = 3 )
Group (d) I型胶原OD值
1 0・57±0・01
2 0・70±0・02"
3 0.91±0.01**
4 0・94±0・05"
5 l・05±0・06"
6 0・86±0・01"
7 0.67±0.01*
1. 2
1
0. 8
0. 6
0.4
0. 2
° Id 2d 3d 4d 5d 6d 7d
时间
图7. Fbs培养液中I型胶原含量测定
二、体内实验
1.凹陷性创伤修复的观察
造模3 h后，见大鼠伤口已止血；至第3d伤口皮肤干燥结痂；10 d
左右背部凹陷性瘢痕已基本形成。注射细胞前观察两侧瘢痕无明显差别, 注射7 d后观察发现，注射细胞侧瘢痕较瘢痕对照侧明显变浅，颜色变淡, 如图8所示。
图8.凹陷性创伤修复的观察。8A示大鼠注射细胞当日情况，左侧背部为注射细胞 侧，右侧背部为瘢痕对照侧；8B示注射7 d后大鼠左侧瘢痕较右侧对照侧明显变浅, 颜色变淡。
2.形态学观察
HE染色观察结果发现，在瘢痕对照侧皮肤真皮层内，细胞均呈长梭 形，细胞核呈淡蓝色，细胞浆呈粉红色；而注射细胞侧皮肤真皮层内这种 细胞数量较瘢痕对照侧明显增多，如图9所示。
图9.真皮层细胞数量对比观察。9A示瘢痕对照侧，细胞在真皮层表达数量少；9B 示注射细胞侧，细胞在真皮层表达数量多（HE, xl00）o
3・vimentin免疫组化染色
S-ABC法对皮肤真皮层内细胞进行vimentin染色。结果发现，胞浆 均呈棕黄色颗粒状反应，细胞核不着色。在瘢痕对照侧皮肤真皮层内，阳 性染色细胞数量较少而浅；而在注射细胞侧这种细胞表达数量增加且颜色 加深（如图10所示）。
图10. vimentin免疫组织化学染色。10A示瘢痕对照侧染色阳性细胞数量〔 10B示注射细胞侧阳性染色细胞数增加且染色浓重（xlOO）。
4. Masson三色染色
Masson三色染色为表皮及皮肤附属器细胞着红色，胶原纤维呈蓝色, 而细胞核染成深蓝色。在本实验的瘢痕对照侧皮肤真皮层中，胶原纤维较 纤细，数量少而且颜色浅；而在注射细胞侧，皮肤真皮层中胶原纤维粗大, 数量多且颜色较深，相互交织成网。说明在注射细胞侧胶原的合成明显多 于瘢痕对照侧，如图11所示。
图11. Masson三色染色。11A示瘢痕对照侧真皮层中胶原表达量少，胶原纤维较细;
11B示注射细胞侧真皮层中胶原表达量多，胶原纤维粗大（xlOO）o
5. I型和III型胶原的免疫组化染色
染色结果判定：在皮肤真皮层中Fbs的细胞浆围绕核周围呈现棕黄色 反应，细胞核不着色；胶原纤维亦被染成棕黄色。
观察I型胶原免疫组化染色结果发现，在瘢痕对照侧真皮层内的成纤 维细胞内及组织中有一定量的阳性表达，胶原染色较淡（图12A）,而在 注射细胞侧的真皮层内成纤维细胞数量较瘢痕对照侧多，且组织中的胶原 染色亦较瘢痕对照侧浓重（图12B）。
III型胶原免疫组化染色结果与I型胶原免疫组化染色结果相似。即注 射细胞侧真皮层中的胶原染色及细胞数量均较瘢痕对照侧多而深（图12C 及图12D）O
尽管在注射细胞后，其真皮层内Fbs、I型胶原及III型胶原含量均较 瘢痕对照侧增加，但对比I型及III型胶原免疫组化染色结果发现，真皮层 内I型胶原的增多较III型胶原的增多明显。
示注射细胞侧成纤维细胞数量较瘢痕对照侧多且组织中的胶原染色亦较瘢痕对照侧 浓重；12C示瘢痕对照侧III型胶原染色；12D示注射细胞侧III型胶原染色及细胞数 量均较瘢痕对照侧多而深(x400)o
第三章讨 论
社会的进步和生活水平的提高，使人们更加注重生活质量。创伤修复 美容治疗和美容除皱作为医学美容重要的组成部分，成为人们越来越关心 的热门话题。
随着年龄的增长，皮肤真皮层结构发生改变⑺，真皮厚度变薄，密度 降低，真皮层内的Fbs抗酶破坏力降低，数量不断减少，胶原纤维和弹性 纤维的数量和质量也随之减少，皮肤的生理活性降低，表现为弹性和光泽 度降低，在表情肌运动较多的部位皮肤松弛产生了皱纹卩10]o
目前美容除皱方法主要有面部提紧术、化学去皮、激光除皱和生物制 剂注射法等。面部提紧术有维持时间长，可整个面部提升的优点，但它存 在手术与修复的时间比较长，影响皮肤弹性和张力，造成面部表情不自然 的缺点；化学去皮和激光除皱方法虽见效快，3〜7d即可消除表浅皱纹， 但它们对深皱纹无效，维持时间短，同时可损伤表皮组织，遗留色素沉着。 国内外正在使用的生物注射制剂主要有肉毒毒素、牛胶原蛋白、透明质酸 酶和胚胎干细胞等[lb 12]o但在这些生物注射制剂的使用过程中，问题相 继暴露出来。肉毒毒素虽能改善面部动态皱纹[⑼，但它会使局部皮肤营 养环境破坏，表情僵硬；胶原蛋白、透明质酸酶是真皮层ECM的主要成 分，在皮肤中起生物替代作用，能使老化的皮肤皱纹减少Z],真皮层的 厚度和ECM得到补充，有除皱效果明显，起效快的特点，但这些成分多 数是异体或异种成分，存在着免疫排斥反应和过敏反应，并且有降解快、 效果持续时间短等缺点20]；胚胎干细胞具有持续的生物美容效果，但 它的来源有限，提纯和保存困难，也不能完全排除免疫排斥反应的缺点 [15]o所以寻找一种简单、安全、微创、持久的美容除皱和修复凹陷性瘢 痕的技术已成为国内外众多学者研究以及化装品厂商关注的热点。
近年一些欧洲国家相继开展了自体细胞除皱技术的临床应用。自体细 胞除皱技术是指将患者的自体细胞经过分离培养后，注射到皱纹和凹陷性 瘢痕部位，通过活体细胞产生和分泌胶原蛋白，这些胶原蛋白可将皱纹和 凹陷性瘢痕填充从而达到美容和治疗的目的。临床应用证明，此技术无排 斥反应及毒副作用，表情自然，疗效显著持久，而且安全可靠［旧。目前 国内对自体成纤维细胞的研究亦日渐增多［17_22］,但有关Fbs对凹陷性瘢 痕以及美容除皱等方面的研究报道极少。
本实验采用自体Fbs的体外培养和凹陷性创伤修复模型的方法，从整 体动物水平和细胞水平对自体Fbs在凹陷性瘢痕中的作用进行初步研究， 以期为成纤维细胞在医学美容除皱中的应用提供可靠的科学依据。
一、Fbs的体外培养
Fbs是构成皮肤真皮层的主要细胞，是真皮层产生胶原和其它ECM 的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能［幻。 凹陷性瘢痕和皱纹均以皮肤真皮层结构发生改变、Fbs数量减少为特征。 因此对Fbs的体外培养，是研究凹陷性瘢痕修复和除皱必不可少的环节。
采用冷胰蛋白酶和胶原酶联合消化法［“ 25］培养皮肤Fbs是本室研究 摸索出的一种新方法。通过对50例女性眼睑部位皮肤（割双眼皮、切除 眼袋等）的Fbs体外培养，其成功率可达100% o表明这种培养Fbs的方 法是稳定可行的。为整体动物实验提供了充分的依据。
采用同样的方法，取大鼠背部皮肤进行原代培养，于第3d倒置显微 镜下观察，贴壁的Fbs呈梭形，胞体较大，胞质透明，细胞核较大，呈椭
圆形，境界清楚，细胞紧密排列，其排列方式为旋涡状、放射状，或栅栏 状。HE染色见胞浆着粉红色，胞核着蓝紫色。vimentin免疫组化染色可 见大于98%的细胞染色阳性，胞浆呈现棕黄色颗粒状反应，胞核不着色, 表明细胞含有波形蛋白，是Fbs。
在利用相同的方法对面积近似的人和大鼠皮肤Fbs的体外培养时发 现，人皮肤Fbs原代培养细胞生长缓慢，接种7 d才达融合状态；而大鼠 皮肤Fbs原代培养细胞生长迅速，接种2~3 d即呈融合状态。人皮肤Fbs 原代培养时间比动物皮肤培养需要的时间长。这种差别固然可以用不同种 属之间的差异来解释，但在同一种属之间甚或是在同一个体，年龄是否亦 可影响其Fbs的原代培养以至胶原等ECM的分泌是有待我们进一步研究 的新课题。
取3~10代对数生长期的大鼠皮肤Fbs[26-28],通过台盼蓝排斥实验进 行Fbs活力检测，其活细胞数为99%以上。并采用MTT比色法，进行Fbs 的生长曲线测定，观察Fbs的生长基本规律。测定结果表明，Fbs在第5 d 时长满，生长状态良好，细胞随时间的增加而增殖。同时，对冻存后复苏 的Fbs活力检测以及生长曲线测定实验结果表明，冻存复苏后Fbs状态良 好，复苏成活率约为85%。倒置显微镜下观察见细胞形态与冻存前无明 显差别。用细胞计数法，所得生长曲线和复苏前MTT法所做曲线基本相 似。由此可以证明，本方法培养的Fbs生物学性状稳定。
综上，通过人及大鼠Fbs的培养及鉴定、活力检测、生长曲线、冻存 复苏后细胞活力生长曲线等有效指标的研究，证明Fbs是一种方法稳定、 增殖能力强、适应性强、易培养且性状稳定的细胞。Fbs的成功培养为人 类凹陷性瘢痕修复和美容除皱提供了可靠的细胞来源。
本实验还利用体外培养的Fbs,对不同时间点Fbs分泌胶原代谢情况
进行研究，为进一步体内实验提供了可靠的依据。
二、Fbs的胶原合成情况
如前所述，Fbs是皮肤真皮层中主要细胞，能合成和分泌胶原蛋 白(collagen)、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、层连蛋白(liminin, LN)、 玻璃粘连蛋白(vitronectin, VN )和透明质酸(Hyaluronic Acid, HA) 等细胞外基质(extracellular matrix, ECM)凹。这些生物大分子构成的 动态网状结构，分布于细胞之间或细胞表面，维持细胞生理活动的微环境。 另外，ECM不仅在细胞之间起机械支撑和连接作用，还是细胞间信号转 导的桥梁，参与细胞的生理和病理过程。
胶原蛋白是ECM中的主要结构蛋白。尽管人体组织内至少发现有19 种胶原卩叫 但在皮肤内分布的胶原只有4种，I型和III型胶原主要分布在 真皮层，IV型和vn型胶原分布在基底膜。正常成年人皮肤I型胶原含量 约占70%, III型胶原约占30%；当皮肤衰老时，胶原含量逐渐降低，二者 比例逐渐倒置，真皮层结构发生改变，厚度变薄，密度降低，皮肤出现 皱纹⑴。所以为了详细了解皮肤Fbs的胶原合成情况，本实验分别利用了 轻脯氨酸测试盒和ELISA的方法对皮肤Fbs培养液中的HYP及I型胶原含 量进行了检测。
HYP在胶原蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中含量极少，其它蛋白均不 存在。HYP在氧化剂作用下产生的氧化物与二甲基苯甲醛作用生成紫红色 化合物，可进行比色定量〔辺。轻脯氨酸测试盒就是利用了这一原理，但 它是用消化液来水解蛋白而释放出HYP,比通常所用的氨胺T法的酸性水 解更加方便、确切。本实验利用耗脯氨酸测试盒测定了不同时间点Fbs培 养液中HYP的含量，可以间接反映培养液中胶原蛋白的含量。结果显示 HYP含量随Fbs的增殖而增加，第3〜5 d的HYP含量与第1 d相比有显著 差异(P<0.01)o由此表明，Fbs培养液中的胶原蛋白含量亦随细胞的增殖 而增加。
由于I型胶原是Fbs分泌的主要成份，在ECM中占很高的比例，本 实验用ELISA方法，检测不同时间点培养液中的I型胶原含量，研究I 型胶原的分泌情况，并对HYP的检测结果加以印证。结果表明，在一定 的时间，Fbs培养液中的I型胶原含量亦随时间的增加、细胞的增殖而分 泌增加，2〜6d I型胶原含量与1 d相比有显著差异(P<0.01)o
三、Fbs对凹陷性瘢痕的作用
在正常情况下，皮肤Fbs处于相对静止状态；当皮肤组织受损后，细 胞则被激活并进入增殖和代谢旺盛期，同时产生许多组织修复因子。可以 说，Fbs是创伤愈合中非常重要的组织修复细胞国-辺，因此研究和控制 Fbs的生物学行为是加速伤口愈合、提高瘢痕愈合质量的基础和关 键［3—0］。
为了观察Fbs对凹陷性瘢痕的修复作用，本实验通过对8例Wistar 大鼠进行双侧皮肤及皮下肌肉的切除手术，造成皮肤凹陷性瘢痕模型。造 模3h后，大鼠伤口已止血；至第3d后伤口皮肤干燥已结痂；10d后背 部凹陷性瘢痕已基本形成。21d后，将从自体皮肤培养的一定数量的Fbs 注射至左侧瘢痕皮下。在注射细胞后，注射细胞侧并未出现红、肿现象， 大鼠活动正常，表明注射的Fbs对大鼠没有排斥和过敏反应；7 d后，注 射细胞侧皮肤瘢痕比瘢痕对照侧明显变浅，颜色变淡。形态学观察发现， 瘢痕对照侧皮肤的真皮层细胞多为长梭形，vimentin免疫组织化学染色证 实，Fbs较少且细胞呈弱阳性表达；Masson三色染色进一步表明，胶原 纤维较纤细，数量少而且颜色浅。由此可以发现，Fbs及其分泌的胶原减 少是引起凹陷性瘢痕形成的主要原因。而在注射细胞侧发现，vimentin阳 性细胞数量多，呈强阳性表达，Masson三色染色见皮肤真皮层中胶原表 达量多，胶原纤维粗大；I型及III型胶原免疫组化染色结果也证实，在注 射细胞侧的皮肤真皮层中I型和III型胶原的阳性染色均较瘢痕对照侧浓 重，在这二型胶原中，I型胶原阳性表达比III型更明显。
综上所述，整体动物凹陷性瘢痕的修复实验是自体成纤维细胞生物功 能研究的继续。两项实验相辅相成，相互印证，从不同的角度证实了应用 细胞培养技术，可大量增殖具有活跃合成与分泌胶原蛋白的皮肤Fbs；将 一定数量的Fbs再注入到皮下后仍可存活并能合成和分泌大量胶原，从而 达到充填凹陷性瘢痕的治疗效果。由于是自体组织细胞，排除了免疫和过 敏反应的缺点，如果将其广泛应用到医学美容，无疑是一种最简单、安全、 微创、持久的美容除皱和修复凹陷性瘢痕方法，使更多的爱美人士焕发青 春光彩，提高生活质量。
第四章结论
本实验通过大鼠凹陷性创伤修复模型和大鼠自体皮肤Fbs体外培养 的方法，采用形态学、生物化学、免疫细胞化学、免疫组织化学、ELISA 等实验技术，从动物模型水平和细胞水平对成纤维细胞形态和功能进行研 究，得出以下结论：
1.采用冷胰蛋白酶和胶原酶联合消化的方法，摸索和建立了一种新 的、适宜于人和大鼠皮肤Fbs的培养方法。
2.经冻存后复苏的大鼠Fbs,其生物学性状与冻存前无明显差别，复 苏成活率约达85%。证明Fbs是一种增殖能力强、适应性强、易培养且 性状稳定的细胞。
3.将体外增殖后的自体Fbs回注至大鼠凹陷性创伤瘢痕的真皮层内， 可合成与分泌I型和III型胶原，在二者中以I型胶原为主，能明显促进凹 陷性瘢痕的修复。
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